Osamu SHIMOMURA (Kioto, 1928 – Nagasaki, 2018), Martin CHALFIE (Chicago, 1949) y Roger Y. TSIEN (Nueva York, 1952 – Eugene, OR, 2016) compartieron el premio Nobel de Química en 2008 “por el descubrimiento y desarrollo de la proteína fluorescente verde GFP”.

Osamu SHIMOMURA se doctoró en Química Orgánica en 1960 en la Universidad de Nagoya. Durante varios veranos trabajó en el laboratorio Friday Harbor de la Universidad de Washington. Fue profesor emérito de la Universidad de Boston. En su disertación del Nobel, titulada “Descubrimiento de la GFP”, recordó que trabajando en Nagoya con el profesor Hirata purificó por cristalización la luciferina de la ostracoda, un crustáceo de tamaño minúsculo. (La luciferina, en presencia de luciferasa y oxígeno se transforma en oxiluciferina y emite luz). Después, en EEUU, hacia 1961, le ofrecieron estudiar la bioluminiscencia de la medusa Aequorea Victoria. La pescó en las corrientes de la costa oeste de Norteamérica y observó que los iones calcio activaban la luminiscencia. Por tratamiento en disolución de sales y EDTA (ácido etiléndiamino tetracético) obtuvo, con 10 000 medusas, unos pocos miligramos de proteína fluorescente. Esta fue la primera fotoproteína descubierta, aequorina, que emitía luz azul en presencia de trazas de iones calcio; pero también obtuvo GFP, que emitía una fluorescencia verde brillante. Más tarde comprobó que la luz azul de la aequorina se transfiere a la GFP y esta trasmite en verde. En 1979, Shimomura y su equipo extrajeron el compuesto fluorescente, el cromóforo, al que llamaron AF-350 porque daba el máximo de absorción a 350 nm. De 100 mg de GFP obtuvieron, tras la extracción y la purificación, 0,1 mg del cromóforo. Era la celenteramida, cuya estructura contenía, como la oxiluciferina, una pirazina sustituida. Formaba una parte de la larga molécula de GFP. Shimomura, al final de su conferencia, aludió a los trabajos realizados en 1994 por Chalfie y Tsien sobre la expresión del GFP en los organismos vivos.

Martin CHALFIE, guitarrista y nadador, se doctoró en Fisiología en la Universidad de Harvard en 1977 y es profesor de Ciencias Biológicas en la Universidad de Columbia, NY, desde 1982. En su discurso del Nobel, titulado “GFP: vida luminosa” (y alegre), dijo haber hecho la tesis con R.Perlman y haber realizado trabajos con S.Brenner, J.Sulston, R.Horvitz y el gusano transparente ‘C.Elegans’ (todos famosos). Coloreó seis células individuales del gusano con ayuda del GFP. Para lograr la expresión de la proteína en el gusano, esto es, para poner GFP en él, utilizó tres métodos: anticuerpos específicos marcados; un gen de la bacteria ‘E.Coli’; hibridación ‘in situ’ del ARNm. Empleando para la clonación ADNc (c de complementario) logró que los espectros de emisión de los GFP recombinante y nativo fuesen coincidentes. Luego se demostró la utilidad del GFP como marcador biológico tanto para la expresión de los genes como para la ubicación de la proteína. Esta era heredable, su visualización no era invasiva y no interfería con otros procesos biológicos. Chalfie mismo empleó las células marcadas con GFP para detectar ubicaciones y mutaciones de diversas clases. También se encontró con dificultades, como la rotura en dos del GFP, que fue capaz de subsanar uniendo las partes con péptidos. Chalfie dijo que Roger Tsien mejoró las propiedades del GFP para que fuese útil en más experimentos: ambos hicieron que brillasen plantas, insectos, peces, ratones y conejos. Y terminó su alocución diciendo que todas las investigaciones con proteínas brillantes están o deben estar dirigidas al estudio de las enfermedades humanas, aunque quién sabe lo que sucederá en el futuro.

Roger TSIEN, estadounidense de origen chino, hijo de un ingeniero de éxito, estudiante muy brillante que fue premiado por sus trabajos en el laboratorio casero, se doctoró en Fisiología en 1977 en la Universidad de Cambridge, UK, trabajó en el Howard Hughes Medical Institute y fue profesor en la Universidad de California, San Diego, desde 1989. En su ‘lectura’ del Nobel, titulada “Construyendo y explotando la caja de pinturas de las proteínas fluorescentes”, dijo que inició su trabajo con los datos y muestras que le pasó el doctor D.C.Prasher, que no podía seguir la investigación por falta de subvenciones, sobre la clonación del gen que codifica GFP y sobre la estructura del cromóforo. Tsien y su equipo consiguieron proteínas fluorescentes mutantes sustituyendo, al principio al azar, un aminoácido por otro. Los cuatro colores expresados en la bacteria ‘E.Coli’ fueron azul, cian, verde y amarillo. Después investigaron la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre mutantes GFP y facilitaron las muestras para la elucidación de la estructura cristalina, por rayos X, de la proteína S65T GFP. Era un cilindro casi perfecto constituido por once hebras beta que rodeaban una hélice situada en el eje central en la que estaba instalado el cromóforo, cuya estructura también fue conocida. Como consecuencia de sus trabajos, Tsien exhibió un panel con quince proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea GFP o de Discosoma RFP (coral rojo, que difiere del GFP en un doble enlace extra que aumenta la conjugación) expresadas en bacterias y purificadas. Todas presentaban fluorescencia excitada a longitudes de onda diferentes y todas tenían colores propios. Tsien finalizó su discurso tratando algunas aplicaciones de los colores fluorescentes codificados genéticamente. Dijo que pueden hacer directamente visibles muchos procesos bioquímicos dentro de las células y los organismos. Por ejemplo, marcando con GFP el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se puede seguir su transmisión de célula a célula a través de ‘sinapsis víricas’ sin exponerse a la neutralización por anticuerpos. También mostró imágenes espectaculares de la división de células, con mitosis en verde e interfases en rojo, así como el progreso del ciclo celular ‘in vivo’ de tumores benignos y malignos.