Stefan W. HELL (Arad, Rumanía, 1962), Eric BETZIG (Ann Arbor, MI, 1960) y William E. MOERNER (Pleasanton, CA, 1953) compartieron el premio Nobel de Química en 2014 “por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de súper resolución”.

Stefan W. HELL, ciudadano alemán nacido en Rumanía, se doctoró en 1990 en la Universidad de Heidelberg. Es director de Química Biofísica en el Instituto Max Planck de Gotinga y jefe de División en el Centro de Investigación del Cáncer en Heidelberg. En su ‘lectura’ del Nobel, titulada “Nanoscopia con luz enfocada”, recordó que con el microscopio óptico no se podía obtener una resolución mejor que la mitad de la longitud de onda de la luz y que, de acuerdo con la ecuación de Abbe, la mejor resolución estaría en los 200 nanómetros, quinientas veces más que el ojo humano. Hell comparó el límite de detección del microscopio óptico con el del microscopio electrónico que es veinte veces menor; no obstante, dijo, en la literatura científica se puede comprobar que se trabaja más con el óptico, aumentando la sensibilidad mediante la unión de las biomoléculas con otras fluorescentes para identificarlas. Pero hay que evitar el agrupamiento de moléculas porque se obtendría una imagen borrosa. Para evitar el borrón, Hell desarrolló la microscopía STED (reducción por cancelación de la emisión estimulada), basada en la evidencia de que el estado fundamental del fluóforo es oscuro, es decir, que para que una molécula emita fluorescencia ha de estar en estado excitado: la emisión estimulada fuerza a las moléculas a su estado fundamental y no son vistas por el detector. En el método se utilizan dos pulsos de láser, uno de estimulación y otro de cancelación con los que se obtiene la señal de fluorescencia de un pequeño volumen del orden de nanómetros: escaneando estos volúmenes se obtiene una imagen muy por debajo del límite de Abbe. Hell mostró dos imágenes del complejo de proteínas de un poro: una hecha con microscopía confocal, un borrón, y otra obtenida con nanoscopia STED en la que se aprecian ocho subunidades moleculares en cada poro. También exhibió la imagen de la cubierta externa formada por proteínas del VIH maduro listo para infectar células próximas, las imágenes de las vesículas sinápticas esféricas de la membrana de los extremos de los axones, y otras varias ¿Dónde está el límite? se preguntaba Hell. Siguieron los métodos GSD y RESOLFT con los que vio filamentos de queratina en células epiteliales vivas de riñón, y otras.

Eric BETZIG se doctoró en 1988 en la Universidad de Cornell, Ítaca, y trabaja en el Howard Hughes Medical Institute. Es líder de grupo en el Janelia Research Campus. En su ‘lectura’ del Nobel, titulada “Moléculas aisladas, células, y óptica de súper resolución”, contó su intento de crear un microscopio óptico con el que ver células vivas; una mala idea, decían, porque contravenía el límite de Abbe y el principio de incertidumbre. Se dedicó a romper la barrera de la difracción en el campo cercano y con sucesivas mejoras consiguió alcanzar los 60 nanómetros de resolución. Exhibió imágenes de células con fluorescencia y las comparó, ventajosamente, con las tomadas en un campo convencional. La fluorescencia era buena porque ofrecía contraste para proteínas específicas, por lo que se marcó como objetivo ver moléculas individuales; pero el campo cercano le resultó demasiado corto ¡Que lo den por el culo!, dijo pensando abandonar. Pero aumentaron el espacio dimensional a 3D para aislar las moléculas y consiguieron todas las coordenadas. Utilizaron las proteínas fluorescentes verdes (GFP) activables por luz UV y visible y crearon la microscopía de localización fotoactivada (PALM) con la que pudieron ver la polimerización en vivo de las actinas, unas proteínas globulares. Como tuvieron problemas con las células recurrieron a la microscopía de iluminación estructurada (SIM), la cual, aunque tiene un límite mayor que la difracción, proporciona mejores imágenes vivas. Betzig mostró imágenes de microtúbulos crecientes, cambios de forma de un protozoo, y otras.

William MOERNER se doctoró en 1982 en la Universidad de Cornell, Ítaca. Es profesor de Química y de Física Aplicada en la Universidad de Stanford, CA. En su lección del Nobel, titulada “Espectroscopia de moléculas aisladas, imágenes, y fotocontrol: Fundamentos de la microscopía de súper resolución”, expuso sus estudios y resultados sobre la detección óptica y espectroscópica de moléculas aisladas mediante la emisión de fluorescencia, trabajando tanto a la temperatura del laboratorio como a baja temperatura, encendiendo y apagando la fluorescencia de la molécula, captando la imagen de una pequeña área muchas veces y superponiendo las imágenes hasta obtener una súper imagen resuelta al nano nivel. (El método es similar al de Betzig, pero ambos trabajaron independientemente). Los fluoróforos (o fluorocromos), de un tamaño aproximado de 1 nanómetro, hacen que una molécula de proteína (por ejemplo GFP) de 3 x 4 nanómetros, absorba energía y la emita a mayor longitud de onda. Moerner y colaboradores obtuvieron imágenes de una proteína bacteriana fusionándola con YFP, una variante amarilla de GFP. También emplearon el método de imágenes en 3D con nuevos fluoróforos. Finalmente, Moerner se refirió al impacto que ha tenido la técnica de espectrometría e imagen de moléculas aisladas en Química: difusión espectral, distorsiones moleculares, estructura de materiales, análisis; en Física: interacciones magnéticas; en Biología: estructuras celulares, comportamiento de membranas; por ejemplo.

Jacques DUBOCHET (Aigle, Suiza, 1942), Joachim FRANK (Siegen, Alemania, 1940) y Richard HENDERSON (Edimburgo, Escocia, 1945) compartieron el premio Nobel de Química en 2017 “por el desarrollo de la crio-microscopía electrónica para la determinación de estructuras en alta resolución de biomoléculas en disolución”.

Jacques DUBOCHET se doctoró en Biofísica en las Universidades de Ginebra y Basilea en 1972, trabajó en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular y es miembro de la Universidad de Lausana. En su alocución del Nobel, presentada con diapositivas y titulada “Crio-microscopía electrónica temprana”, dijo que cuando hizo sus primeras imágenes de moléculas, treinta años atrás, trabajaba con una resolución de 35 angstrom, pero que la reciente revolución de la crio-microscopía electrónica (crioEM) tiene como consecuencia que a 3,5 angstrom los átomos son visibles y podemos ver cómo se sitúan los átomos en las moléculas. Dubochet resaltó la importancia de la preparación de las muestras para el microscopio electrónico: es necesaria, dijo, que el agua sea vítrea, esto es, un sólido amorfo, no cristalino, lo que se consigue enfriando con etano a la temperatura del nitrógeno líquido. Así consiguió imágenes de moléculas biológicas que sirvieron para pasar de la química a la medicina. Con su sentido del humor, confesó que los tres premiados eran biofísicos, científicos que trabajan en biología con el espíritu de un físico, que sin haber sido nunca buenos químicos habían recibido un Nobel de Química, promocionándose, de acuerdo con el principio de Peter, hasta alcanzar su propio nivel de incompetencia; no obstante cree que el premio es un testimonio de la unidad de la ciencia.

Joachim FRANK se doctoró en la Universidad Técnica de Munich en 1970, trabajó en el Howard Hughes y es miembro de la Universidad de Columbia, NY. En su discurso del Nobel, titulado “Reconstrucción de partículas aisladas. Historia de una muestra”, explicó que empleaba temperaturas criogénicas de -135ºC para evitar los cristales de hielo y cortaba rebanadas de la muestra de decenas o centenas de espesor para introducirlas en el alto vacío del microscopio electrónico de transmisión. Las imágenes bidimensionales las reconstruía por simetría helicoidal o icosaédrica y aplicando la transformada de Fourier en tridimensionales. Así consiguió reconstrucciones 3D de partículas aisladas. Por ejemplo: de glutamina sintetasa promediando con computadora; micrografías de la subunidad 40S del ribosoma de células HeLa; de la 50S de la E. Coli; del ARNt actuando como resorte molecular durante la descodificación; del virus de la hepatitis C invadiendo el ribosoma; y otras.

Richard HENDERSON se doctoró en la Universidad de Cambridge, Inglaterra, en 1969, estuvo de posdoctoral en la Universidad de Yale y volvió en 1973 al Laboratorio de Biología Molecular MRC. Está considerado como un pionero de la crio-microscopía electrónica. En su discurso del Nobel, titulado “De la cristalografía electrónica a la crioEM de partículas aisladas”, exhibió unas diapositivas tan brillantes como las de sus copremiados. Por ejemplo, las que muestran la estructura de la rodopsina bacteriana, realizada con una alta resolución de 3,5 angstrom y construida a partir de setenta imágenes. Las coordenadas facilitadas por la crioEM fueron utilizadas para el emplazamiento de los átomos en la estructura molecular determinada por cristalografía de rayos X. Henderson también mostró imágenes de las estructuras de las enzimas piruvato deshidrogenasa, de 1,6 Mdalton, y beta- galactosidasa, de 450 KDa, así como del complejo mitocondrial de 1900 KDa. Y otras.